RNA mensageiro em nanopartículas lipídicas resgata células HEK 293 de lipídeos

Scientific Reports volume 12, Número do artigo: 22293 (2022) Citar este artigo

2190 acessos

5 Altmétrica

Detalhes das métricas

As ferramentas analíticas para estudar a fisiologia celular são essenciais para otimizar as interações droga-hospedeiro. A espectroscopia de NMR de perseguição de pulso em tempo real, RTPC-NMR, foi introduzida para monitorar a cinética da produção de metabólitos em células HEK 293T tratadas com nanopartículas lipídicas semelhantes à vacina COVID-19, LNPs, com e sem mRNA. Parâmetros de fluxo cinético foram resolvidos para a incorporação de marcador isotópico em metabólitos e eliminação de metabólitos marcados das células. Alterações nos tempos característicos de produção de alanina implicaram disfunção mitocondrial como consequência do tratamento das células com nanopartículas lipídicas, LNPs. A disfunção mitocondrial foi amplamente diminuída pela inclusão de mRNA nas LNPs, cuja presença aumentou o tamanho e a uniformidade das LNPs. A metodologia é aplicável a todas as células cultivadas.

O notável sucesso das nanopartículas lipídicas de mRNA modificadas por pseudouridina, à base de LNP, vacinas contra COVID-19, que aproveita a maquinaria translacional inata alimentada pelo metabolismo celular, impulsiona essa tecnologia para a vanguarda da medicina1,2,3,4,5,6 . Muitas aplicações potenciais de mRNA LNPs para tratar doenças crônicas, como diabetes7,8,9, cânceres e distúrbios genéticos10,11 foram testadas. A terapêutica baseada em RNA mensageiro utiliza um conjunto complexo de moléculas biológicas que devem ser otimizadas para cada aplicação. Essas células podem superar as células circundantes pelos escassos recursos de nutrientes nos tecidos vivos? Quanto tempo durará a produção efetiva de produtos gênicos de mRNA? A degradação de mRNA LNPs, que libera metil pseudouridina, inibirá a transcrição? Os lipídios que constituem as LNPs danificam o plasma e as membranas celulares internas? Essas questões são críticas e devem ser abordadas para facilitar a implementação terapêutica.

A resposta dinâmica das células aos tratamentos medicamentosos pode ser avaliada pelo perfil metabólico, que geralmente é realizado usando espectroscopia de massa ou espectroscopia de RMN12,13. A metodologia normalmente requer lise celular e extração para detectar as concentrações totais de metabólitos, fornecendo instantâneos da fisiologia celular durante um período de horas a dias que é inerentemente tendencioso devido aos processos de várias etapas necessários para preparar amostras12,13. A metodologia invasiva interrompe a estrutura compartimental das redes metabólicas e pode não refletir os processos reativos que ocorrem após a absorção da vacina baseada em LNP. A espectroscopia de NMR em tempo real usa abundância natural de 13C ou análises baseadas em rastreadores para identificar metabólitos coletando espectros 1H editados com isótopos 13C das células, permitindo a aquisição rápida de dados, aumentando assim a resolução temporal dos experimentos para 10 minutos ou menos14,15.

Estudos metabolômicos baseados em RMN em tempo real mais recentes usam um biorreator para manter as células em um estado fisiologicamente ativo e podem detectar metabólitos intracelulares livres, mas não têm a capacidade de monitorar as principais reações, como a glicólise, que ocorrem ao longo de minutos16,17,18 . A introdução da espectroscopia NMR de perseguição de pulso em tempo real, RTPC-NMR, combina o uso de 13C-glicose e NMR de prótons editados em 13C com uma criosonda ultrassensível NMR19 e o design aprimorado de um biorreator20 para aumentar a resolução de tempo dos experimentos para 47 s permitindo mudanças rápidas nos fluxos metabólicos em resposta a estímulos a serem seguidos. Os metabolitos marcados com 13C são observados contra um fundo não marcado. Este método representa a vanguarda da tecnologia para analisar a saúde celular, capturando a dinâmica da incorporação de carbono 13C de maneira imparcial para revelar como os estímulos afetam as vias metabólicas.

O mRNA de Luciferase modificado contendo N1-metilpseudouridina em vez de uridina foi preparado por transcrição in vitro com base em um protocolo publicado anteriormente21,22 e foi usado para todos os experimentos. A incorporação de N1-metilpseudouridina aumenta a estabilidade do mRNA e aumenta a expressão de proteínas em células de mamíferos22,23. O transcrito purificado incluiu uma cauda poli(A) 3' de ~ 150 nucleotídeos e Cap124 5' para facilitar ainda mais a tradução da proteína (Figura complementar 1). O mRNA modificado foi transfectado em células HEK 293T por 24 h usando cinco reagentes de transfecção (Fig. 1a, Tabela Suplementar 1). Células HEK 293T foram previamente utilizadas para monitorar a captação e expressão do mRNA da Luciferase21,22. Consistente com Kariko et al.21,22, apenas um reagente, Lipofectamine 2000, LF, entregou mRNA suficiente nas células para gerar um sinal de luminescência dependente de luciferase.

24 h, consistent with a high energy charge and metabolically active cells33. HEK 293T cells were packaged as previously described into small, ~ 0.6 mm diameter, alginate beads by using an atomizer20 and modified Krebs–Henseleit, KH, buffer34, a classical chemically defined35 serum-free medium used to study cardiomyocytes. KH buffer salts were supplemented with glucose, bovine serum albumin, BSA, insulin, and palmitic acid. The critical feature of the bioreactor is a microporous irrigation stem (Fig. 3a) that permits uniform distribution of the fresh medium across packed cell beads33 in 5 mm NMR tube and facilitates quick exchange of the medium from the ~ 200 µL NMR sampling volume. A 15 mL pulse of uniformly labeled [U, 13C]-glucose was administered through an injection loop attached in line with the medium delivery tubing and controlled by a mechanical switch (Fig. 3a). To avoid the formation of air bubbles, the inner diameter of the tubing was matched with the orifices of the joints throughout the device. Flow was controlled by a peristaltic pump to deliver 100–200 uL/min. The performance of the device was optimized to introduce a pulse of labeled glucose with a rise time, ~ 10 min, that is faster than the characteristic time of glycolysis, 10–20 min36. To that end the experimental temperature was adjusted to 300 K to slow cellular metabolism37. The optimization runs showed that 10 million cells packaged into alginate beads and fed by using a microporous irrigation stem are able to consume ~ 25% of the 13C-glucose administered over the course of the experiment (Supplementary Figure 2)./p>